RAS突变和剪接变异
RAS突变是许多癌症类型的基因驱动因素，包括结直肠癌(CRC)、胰腺导管腺癌(PDAC)、肺腺癌(LUAD)、非小细胞肺癌(NSCLC)、黑色素瘤和某些血液学癌症的某些亚型。尽管这些肿瘤类型由RAS突变驱动，亚型(KRAS、NRAS或HRAS)、密码子和RAS突变频率都因组织类型而异。
例如，大部分LUAD(3%)、PDAC(86%)和CRC(41%)是由KRAS突变驱动的，KRAS突变主要发生在这些肿瘤类型的1密码子上。相比之下，9%的黑素瘤是由NRAS突变引起的，与KRAS不同的是，这些突变发生在61密码子上。
HRAS突变的发生频率低于KRAS或NRAS，但一系列头颈部鳞状细胞癌(HNSCC；和膀胱癌(6%)是由HRAS突变驱动的，这些突变发生在密码子1或61上。基因工程小鼠模型(GEMMs)概括了在病人肿瘤中观察到的亚型和密码子突变偏好。KrasG1D在结肠上皮细胞中的表达可导致细胞过度增殖，而NrasG1D在结肠上皮细胞中的表达不影响细胞增殖。NrasQ61R在黑色素细胞诱导的黑色素瘤中表达，而非NrasG1D。因此，靶向RAS驱动的癌症的方法必须对应特定的亚型和特定的密码子突变。
KRAS基因编码两个使用不同外显子4s的剪接变异，产生KRAS4A和KRAS4B两种剪接体。KRAS4A在C端还含有或3个氨基酸，因此具有不同的翻译后修饰和膜定位。KRAS4B一直被认为是主要的异构体，因为它在人类肿瘤中广泛存在且高表达。然而，最近发现KRAS4A在癌细胞株中广泛表达，在结直肠癌中表达水平与KRAS4B相当。KRAS4A在GEMMs中是可有可无的；4A外显子的遗传缺失胚胎可以存活，而Kras的缺失导致胚胎的致死。
最近，Kras4B在小鼠体内也被证明是可有可无的，这表明这两种亚型在发育过程中功能上是冗余的。然而，Kras4A或Kras4B的缺失导致了对肺部的肿瘤形成的抗性，这表明肿瘤的启动需要这两种亚型。这两种亚型可能在肿瘤微环境中也有特定的作用。
KRAS4A的表达增加了对应激的适应性，如缺氧，KRAS4B在干细胞和祖细胞中表达。肿瘤可以通过剪接来适应在压力下表达KRAS4A。这些最近的研究补充了KRAS4A在肿瘤发生中的作用，并改变了抑制KRAS的传统观点，因为KRAS4A现在也需要考虑在内。
RAS突变体的生化特征
小的GTPases，如RAS，在GTP结合的不活跃状态和GTP结合的活跃状态之间循环。鸟苷酸交换因子，如SOS或Ras鸟苷酸释放蛋白，促进GDP交换成GTP。为了促进GTP的水解从而使得Ras回归到GDP状态，就需要Ras的GAP们，如神经纤维瘤蛋白(NF1)或p10GAP，来介导GTP的水解。RAS密码子1、13和61的突变破坏了GTP介导的水解，允许这些突变体在GTP结合状态持续积累。GTP结合的RAS激活下游效应通路促进细胞增殖，最常见的是MAPK和PI3K通路。
不同RAS突变体的内在GTPase活性和GDP-GTP交换比例可能不同，这一实验结果可能为如何最佳靶向每个突变体提供了依据。例如，密码子1、13和61突变通常会降低固有的GTPase活性，KRAS-G1C除外，尽管其p10介导的水解速率降低，但KRAS-G1C表现出接近野生型固有的GTPase活性。事实上，Shokat和同事利用KRAS-G1C独特的生化特性，利用与KRAS-G1C的GDP结合状态结合的共价抑制剂靶向KRAS-G1C。相比之下，KRAS-G13D相对于野生型RAS具有更高的内在交换活性，表明其受GDP约束的状态是短暂的。密码子13突变的KRAS对NF1GAP介导的水解部分敏感，而密码子1或61突变的KRAS亚型对NF1不敏感。有趣的是，KRAS密码子13突变经常与NF1突变共突变，进一步证明了肿瘤的进化压力。RAS突变类型之间的生化差异决定RAS的核苷酸结合状态不同，因此等位基因特异性抑制剂最适合用于靶向RAS。直接靶向RAS的方法
直接靶向抑制RAS是治疗RAS突变肿瘤的理想方法。在这里，作者强调了在直接靶向RAS方面的最新成果，包括switch-II突变体选择性共价抑制剂和pan-RAS抑制剂的开发。
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靶向KRAS-G1C的共价抑制剂
Kras对小鼠的发育至关重要，而Nras和Hras则是可有可无的。如果人类在这方面是相似的，当针对野生型KRAS蛋白时，这种对KRAS的需求就会导致*性问题。然而，当Kras被Hras取代时，小鼠体内是可行的，这减少了对*性的担忧。
在成年小鼠中有条件地删除Kras可以直接检验这些问题，但此类研究尚未发表。由Shokat和他的同事开创的RAS抑制剂领域，重点研究了KRAS-G1C的共价抑制，这将有望规避抑制所有RAS亚型的*性。
在KRAS-G1C的1号密码子上发现的半胱氨酸突变的固有化学性质，可以用于开发共价小分子抑制剂。共价靶向半胱氨酸活性位点是药物发现中广泛应用的策略。重要的是，野生型KRAS活性位点缺乏半胱氨酸，因此可以通过这种共价方法特异性抑制KRAS-G1C。如前所述，G1密码子是KRAS的一个突变热点，而G1C是该位点第三常见的突变。G1C突变主要发生在LUAD中，是与吸烟相关的转位突变(GT和GC)。
Shokat和同事首先在突变的KRAS-G1C蛋白中，在switch-II后面发现了一种新的变构结合口袋，称为switch-II口袋。他们开发了第一批KRAS-G1C的不可逆抑制剂。这些化合物以GDP结合状态结合KRAS-G1C，阻断SOS-催化的核苷酸交换，阻断KRAS-G1C与RAF的结合。
值得注意的是，这些化合物仅与GDP结合态的KRAS-G1C结合，因此需要KRAS-G1C首先进行GTP水解。稳定状态下，KRAS-G1C约有75%与GTP结合，但KRAS-G1C在常见的致癌突变中具有最高水平的内在GTPase活性，因此容易受到共价攻击。由于KRAS中除KRASG1C外的突变具有较低的GTP水解速率，因此目前还不清楚通过类似的方法在其他突变体中靶向switch-II口袋是否会成功。
许多公司正在开发更有效的KRAS-G1C抑制剂，其中一些分子正在进行临床试验，但细节尚未公布。AMG是第一个进入临床试验的分子，I期试验的初步结果是有希望的，特别是在非小细胞肺癌中：13名患者接受mg的目标剂量，7名患者部分缓解(PR)，6名患者病情稳定(SD)。结直肠癌的活性则远没有那么显著：1例患者中只有1例有PR,10例有SD。
值得注意的是，在研究的34名患者中，没有人显示出剂量限制*性或不良事件导致停药。在临床前模型中，AMG仅能有效地抑制KRAS-G1C细胞系的细胞活力(分别在MiaPaCa-和NCI-H细胞系中半抑制浓度(IC50)为9nM和6nM，并在异种移植模型中诱导肿瘤消退。当AMG与RAS激活或被RAS激活的蛋白抑制剂(如MEK、AKT、PI3K、SHP和EGFR家族成员)或与免疫治疗结合时，AMG具有协同抑制生长的作用。
MRTX也处于I/II期临床试验；在早期临床研究中(在7例患者中，每日两次mg)，5例NSCLC患者中有3例获得PR,例CRC患者中有1例获得PR。在临床前模型中，MRTX仅能显著降低KRAS-G1C细胞系的细胞存活率(IC50=94nM和IC50=nM分别在MiaPaCa-和NCI-H细胞中)，并在异种移植模型中导致肿瘤消退。
当与EGFR家族、SHP、mTOR或细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)和CDK6抑制剂联合时，MRTX表现出协同效应，甚至在MRTX-难治肿瘤中，也能导致肿瘤消退。在CRISPR筛选中，NRAS或KEAP1缺失导致MRTX耐药，而SHP、MYC或mTOR通路基因缺失则使肿瘤对MRTX进一步敏感。
第三个KRAS-G1C共价抑制剂JNJ-(ARS-)，目前正在一期临床试验中，研究结果尚未公布。前两种化合物(ARS-和ARS-)仅在KRASG1C突变的肿瘤细胞系中，减少细胞生长并抑制对MAPK的下游信号传导。第四种KRASG1C共价抑制剂LY目前正处于I/II期临床试验阶段，作为单一疗法和与CDK4/CDK6或EGFR抑制剂或化疗(多西他赛)进行联合用药。研究结果尚未公布。
由于所讨论的共价抑制剂要求KRASG1C处于GDP结合状态，KRASG1C中可能出现耐药突变，使GTPase活性丧失，或促进GTP与GDP的鸟嘌呤交换。对共价KRAS-G1C抑制剂的耐药机制已通过CRISPR筛选确定，包括NF1或其他RAS亚型(NRAS和HRAS)的缺失。
最近，已经发现了能够同时结合KRAS的GDP结合态和GTP结合态的分子。这些分子结合一个新的凹槽(switch-II凹槽)，它靠近switch-II口袋，但远离核苷酸结合位点。这一发现突出了switch-II口袋的动态性质，重要的是，提供了概念上的证据，证明两种RAS的核苷酸结合状态都可以被抑制剂靶向。
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其他针对突变的方法
如上所述，KRASG1C突变只占KRAS突变的一部分，主要在LUAD中发现。为了有效抑制KRAS其他常见突变KRASG1D和KRASG1V，需要采取不同的方法，因为这些突变体在活性部位缺乏活性半胱氨酸。针对这些特定突变的抑制剂的开发将需要考虑生化差异，并评估哪一种状态（与GDP或GTP结合）为目标，因为每种突变将在这些状态的相对流行程度上有所不同。
RevolutionMedicines正在开发一种三复合物平台，RAS(ON)，在该平台上，一种化合物介导不同突变KRAS蛋白(包括KRAS-G1C)和伴侣蛋白(如亲环素a)之间的非天然蛋白-蛋白相互作用。这种复合物的形成阻止KRAS突变体蛋白结合SOS和RAS结合域(RBD)效应蛋白。有趣的是，这些分子(RM-和RM-)在GTP结合状态下，分别与KRAS-G1C和KRAS-G13C共价结合，在细胞中具有抗增殖活性。
RAS-effector互作抑制剂
虽然特异性靶向突变体KRAS-G1C的共价抑制剂是有效的，但为每种突变RAS蛋白确定有效的治疗方法将是繁琐的。直接靶向所有RAS蛋白(KRAS4A、KRAS4B、NRAS和HRAS)上的保守配体结合位点，可以提供一种单一的治疗方法来抑制RAS基因的突变和肿瘤类型。
其中一种化合物，化合物，结合了switch-I中的一个保守残基Asp38，并阻断RAS效应蛋白的结合。化合物体外结合野生型KRAS、NRAS和HRAS，抑制KRAS-G13D肿瘤的体内生长；然而，*性和脱靶活性不容忽视。事实上，pan-RAS抑制剂不太可能被耐受，因为RAS在正常细胞信号传递中是必不可少的。所有三种RAS亚型的缺失导致小鼠模型的胚胎致命性和体外细胞无法增殖。
早期研究的RAS结合小分子DCAI对SOS1介导的RAS核苷酸交换有弱的抑制作用。与KRAS共结晶表明，DCAI结合了一个口袋之间的螺旋和核心的β折叠，β1-β3，这里被称为DCAI口袋，它阻止RAS和SOS1之间的相互作用。结合在DCAI口袋中的小分子阻止了SOS1介导的鸟嘌呤交换，因此RAS蛋白不能采用GTP结合的活性状态，使这个口袋成为理想的药物靶点。
Abd-和Ch-这两个独立的蛋白互作化合物系列可逆地结合RAS中的DCAI口袋，抑制CRAF、RalGDS和PI3K的pα和pγ催化亚基与突变的KRAS、NRAS或HRAS的相互作用。第三个化合物BI-85也结合了DCAI口袋，减少了SOS1介导的交换，从而减少了下游激酶ERK和AKT46的磷酸化。
这些系列作为pan-RAS抑制剂；DCAI口袋存在于野生型RAS蛋白中，因此这些化合物不是突变型选择性抑制剂。需要进一步的研究来优化突变体选择性参数，因为pan-RAS抑制可能带来*性问题。
间接靶向RAS的方法
正常的RAS激活需要核苷酸交换、加工、膜定位和效应蛋白结合等步骤。改变这些基本步骤之一可以用来间接抑制RAS激活。
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SOS抑制剂
通过阻断GEF对RAS的活性，发现了一个小分子结合KRAS在switch-I和switch-II之间，从而抑制了SOS的结合和SOS介导的核苷酸交换。接下来尝试抑制SOS1-RAS的相互作用，使用的分子设计模仿一个正位的SOS螺旋。虽然该化合物与SOS1的结合具有纳摩尔亲和力，但其细胞活性较低。研究领域随后转移了注意力，试图找到SOS1的小分子抑制剂。
三个研究小组鉴定了结合SOS1的CDC5结构域和在RAS-SOS1-RAS三元复合物中RAS上Switch-II附近区域的小分子。有趣的是，小分子与这个位点结合可以激活或抑制SOS1-RAS的相互作用。一个研究小组鉴定出一种小分子抑制剂(BAY-93)在纳摩尔水平抑制SOS1-KRAS的相互作用。而BAY-93对KRAS突变型细胞增殖的抑制作用较弱(IC50=3μM)，但对野生型KRAS细胞增殖的抑制作用较强(IC50=1μM)。
值得注意的是，BAY-93和KRAS-G1C共价抑制剂ARS-在KRAS-G1C细胞模型中显示出协同抑制生长的作用。这一观察结果表明，SOS1抑制剂可以与GDP结合的KRAS-G1C抑制剂联合使用，因为抑制SOS1会增加GDP结合态的KRAS-G1C的比例。目前，SOS1抑制剂BI-作为单一药物和MEK抑制剂trametinib联合使用正在进行一期临床试验。
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SHP抑制剂
SHP是非受体蛋白酪氨酸磷酸酶，MAPK通路的完全激活需要它。编码SHP的PTPN11基因突变会导致RASopathies遗传综合征，约50%努南综合症患者都有这种基因突变。虽然SHP的生物学功能尚不清楚，但在目前的模型中SHP作为一种支架蛋白，结合GRB和SOS1，从而增加RAS核苷酸的交换。对SHP的抑制作用类似于SOS1抑制剂，可以阻止GTP结合野生型RAS。KRAS-突变型肿瘤依赖于SHP，因为研究发现，Ptpn11的缺失会延迟肿瘤进展，但不会导致肿瘤退化。在筛选自抑制构象锁定SHP的分子化合物库中，发现了SHP-可有效地变构抑制SHP(IC50=0.μM)。在KRAS-G1D患者来源的类器官和PDAC和NSCLC60异种移植模型中联合给药SHP-与曲美替尼，协同降低细胞增殖。然而，在KRAS-G13D突变细胞株MDA-MB-31中未观察到对SHP-的敏感性。一种有效的选择性SHP变构抑制剂，RMC-，与SHP-在同一位点结合，稳定SHP的自抑制构象。在临床前模型中，RMC-降低了细胞增殖，但这种效应只在KRAS密码子1突变的细胞中明显，而不是密码子13或61突变的细胞。此外，在KRASG1C突变细胞中观察到最大的敏感性；KRASG1D或KRASG1V突变型细胞对该化合物有一定的敏感性。这一观察结果强调了每个突变的生化特性决定了RAS活性依赖于鸟嘌呤交换的程度，并且内在或GAP-介导GTP水解活性升高的突变对SHP抑制特别敏感。来自RMC-的临床候选药物RMC-，目前正处于一期单药治疗临床试验和Ib/II期临床试验联合另一种MEK抑制剂考比替尼。另一种SHP变构抑制剂JAB-目前正处于I/II期临床试验阶段，结果尚未公布。第三种SHP抑制剂TNO正在进行一期单药治疗临床试验和联合MRTX的I/II期临床试验。这些研究的结果尚未发表。03
RAS加工抑制剂
RAS只有在定位于细胞膜时才有活性。为了与膜结合，RAS需要三个酶翻译后处理步骤：法尼基转移酶(FTase)或香叶基转移酶(GGTase)对CAAX盒进行预酰化；RAS转换酶(RCE1)对AAX末端残基的裂解；异戊基半胱氨酸羧基甲基转移酶(ICMT)对CAAX盒半胱氨酸残基的甲基化作用。抑制RAS的加工应该可以阻断膜关联和下游RAS信号。
尽管在KRAS突变型肿瘤中，FTase抑制剂(FTIs)的临床表现令人失望，这可能是由于FTase和GGTase之间的功能冗余，但人们重新